Un nuovo sito di legame tra la tensione

Rapporti scientifici volume 13, numero articolo: 13986 (2023) Citare questo articolo

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Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per analizzare le interazioni proteina-proteina utilizzando un sistema di espressione procariotico a doppia induzione. Per valutare il legame proteina-proteina, è stato costruito un gene chimerico della tossina di fusione utilizzando un breve frammento di DNA trattato con DNasi (libreria di epitopi) e CcdB, che codifica per una tossina della topoisomerasi II del DNA. Le interazioni proteina-proteina influenzerebbero l’attività della tossina, con conseguente formazione di colonie. Utilizzando questo nuovo sistema, abbiamo trovato un nuovo sito di legame nella subunità α1 del canale del calcio voltaggio-dipendente (CaV1.2) per la subunità β2 del canale del calcio voltaggio-dipendente. Lo screening dell'espressione procariotica della subunità β2 utilizzando una libreria di epitopi di CaV1.2 ha prodotto due cloni sovrapposti della sequenza C-terminale di CaV1.2. Le analisi di sovrapposizione in vitro e di immunoprecipitazione hanno rivelato un legame preferenziale delle sequenze C-terminali di CaV1.2 e β2.

Le interazioni proteina-proteina vengono generalmente studiate utilizzando tecniche biochimiche come la reticolazione, la coimmunoprecipitazione, la visualizzazione dei fagi e test ibridi lievito-due. La reticolazione dipende dalle reazioni chimiche nella proteina bersaglio1,2,3.

La visualizzazione dei fagi utilizza i batteriofagi per connettere i geni a un gene della proteina del rivestimento dei fagi, dando come risultato un fago che mostra le proteine ​​all'esterno dei batteri2. La visualizzazione dei fagi richiede il bio-panning seriale (selezione per affinità) in vitro. Il sistema a due ibridi del lievito dipende dall'attivatore trascrizionale Gal4 di Saccharomyces cerevisiae1,3. Gal4 attiva la trascrizione di un gene coinvolto nell'utilizzo del galattosio. I sistemi a due ibridi sono stati utilizzati per scoprire le interazioni proteina-proteina3. Tuttavia, i sistemi di screening a due ibridi del lievito hanno un alto tasso di falsi positivi. Poiché i sistemi a due ibridi dipendono dall’attività trascrizionale, è necessario un mezzo per analizzare direttamente le interazioni proteina-proteina.

Abbiamo generato un sistema di espressione procariotico dual-inducibile, pdMAX4. pdMAX è costituito da due sistemi di espressione inducibili: un'unità promotrice di arabinosio e un'unità inducibile isopropil-β-d-tiogalattoside (IPTG). Ciò consente a due geni di essere espressi in un batterio (Escherichia coli). Se due molecole interagiscono tra loro e una di esse ha una funzione biologica, questa funzione biologica potrebbe essere influenzata dall'interazione. Pertanto, pdMAX può essere utilizzato per lo screening delle interazioni proteina-proteina.

pdMAX contiene CcdB, che è una tossina della DNA topoisomerasi II. Con l'induzione di arabinosio o IPTG, un plasmide senza DNA esterno esprime la tossina CcdB, prevenendo così la formazione di colonie. In altre parole, i plasmidi ricombinanti con DNA esterno promuovono la crescita di colonie batteriche. Se il DNA inserito forma una proteina chimerica con CcdB e la proteina chimerica mantiene l'attività della tossina, pdMAX potrebbe essere utilizzato per l'analisi dell'interazione proteina-proteina.

In questo studio, abbiamo creato una libreria di epitopi da una chimera della subunità α1 del canale del calcio voltaggio-dipendente dei mammiferi con CcdB sotto il promotore/operatore lac nel plasmide pdMAX. Inoltre, abbiamo inserito il gene della subunità β2 con il promotore dell'arabinosio nel sistema pdMAX. Utilizzando il sistema pdMAX, abbiamo trovato un nuovo dominio di interazione nella subunità α1.

Per lo screening dell'interazione proteina-proteina in E. coli, abbiamo utilizzato il plasmide pdMAX, che è un doppio sistema di espressione procariotica4.

Come esperimento di controllo, è stato preparato un costrutto a doppia espressione del gene della subunità CaVβ2 a lunghezza intera nell'unità arabinosio e nel dominio di interazione CaV1.2-α (AID) -iUnit (Figura 1 supplementare). L'induzione di IPTG non ha comportato la formazione di colonie a causa del gene chimerico di AID e iUnit (CcdB)5,6. L'induzione da parte di arabinosio (espressione del gene CaVβ2) e IPTG (espressione del gene AID-iUnit) ha portato alla formazione di colonie a causa di un'interazione tra CaVβ2 e AID, che ha ridotto l'attività della tossina CcdB (Figura 1c supplementare).